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熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)原則 引物設(shè)計(jì)原則

百科

熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)原則 引物設(shè)計(jì)原則

引物設(shè)計(jì)原則是：


1、引物長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大于38bp 。


2、引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜 ， 上下游引物GC含量和Tm值要保持接近 。


3、引物所對(duì)應(yīng)的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳 ， 5'到 3’的下降形狀也有利于引物與模板的結(jié)合 。


4、ΔG值（自由能）反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度，3'端的ΔG值相對(duì)要低，且絕對(duì)值不要超過9，否則不利于正確引發(fā)反應(yīng)，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，但在-6時(shí)只達(dá)到40%，-8時(shí)少于20%，-10時(shí)接近于0 。



5、錯(cuò)配率一般不要超過100，否則會(huì)出現(xiàn)非目的條帶 。但對(duì)于某些特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率 。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為340以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為110，并且不好找到其他更合適的引物，那么這對(duì)引物是可以接受的 。



6、Frq曲線為Oligo6軟件新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，解釋了序列片段存在的重復(fù)幾率大?。∪∫鍤? ，應(yīng)該用Frq值相對(duì)較低的片段 。


7、引物二聚體及發(fā)卡結(jié)構(gòu)的能量的絕對(duì)值一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR不能正常發(fā)生 。



8、3'端最好不要是連續(xù)堿基，GGG或CCC會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的引發(fā)，同時(shí)3'端最后一個(gè)堿基最好不要是A或T，若是，會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配 。


9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5計(jì)算Tm值，也就是退火溫度 。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應(yīng)的退火溫度，最好保證每個(gè)引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內(nèi) 。


10、模板與穩(wěn)定性較小的引物之間的Tm的差異越小，PCR的效率越高 。因?yàn)榻怄湝囟纫踩Q于它的長(zhǎng)度，如果期待的產(chǎn)物長(zhǎng)度等于或小于500bp ， 選用端的引物（16-18bp） ， 如果產(chǎn)物長(zhǎng)5kb，則用24bp的引物 。


11、在DNA測(cè)序和PCR中最好用5'末端穩(wěn)定（GC含量多），而3'端不穩(wěn)定（AT含量多）的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng) 。


12、引物和產(chǎn)物之間的Tm值相差別太大，20攝氏度范圍內(nèi)最好 。


【熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)原則 引物設(shè)計(jì)原則】13、對(duì)引物的修飾一般在5'端進(jìn)行，例如加酶切位點(diǎn)，加酶切位點(diǎn)的同時(shí)要根據(jù)需要添加保護(hù)堿基 。

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